伊布替尼治疗依赖性血小板功能

  抽象 口服布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂伊布替尼最近证实了复发性B细胞恶性肿瘤患者的高效率。据报道，在伊布替尼治疗的患者亚组中出现了出血事件。我们证明伊布替尼选择性抑制血小板信号传导和胶原受体糖蛋白VI下游的功能，并强烈影响动脉血流下血管性血友病因子(VWF)上的血小板粘附。对14名患者进行的纵向研究表明，出血事件的发生与血小板富集血浆中胶原蛋白对血小板聚集的减少和动脉血流对VWF的牢固粘连有关。添加50%未处理的血小板足以有效逆转伊布替尼的作用，由于发生生理性血小板更新，治疗中断后血小板功能恢复。这些数据具有重要的临床意义，为伊布替尼治疗期间的止血管理提供了基础。 介绍 布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)是B细胞受体下游的重要参与者，其共价抑制剂伊布替尼最近被批准用于治疗复发性慢性淋巴细胞白血病(CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)。出血已在依罗替尼治疗的患者的高达50%的报道。大多数事件是1至2级(自发性瘀伤或瘀点)，但在5%的患者中，他们在创伤后为3级或更高。血小板是血管损伤后预防出血最重要的血细胞。两种Tec家族激酶Btk和Tec通过磷脂酶Cγ2(PLCγ2)磷酸化和激活参与胶原受体糖蛋白VI(GPVI)下游的血小板活化。在动脉剪切速率，与受损血管壁的血小板的相互作用通过与其受体的GPIB-IX-V复合物血管性血友病因子(VWF)的结合介导的大部分。在小鼠模型中，已显示Btk在VWF / GPIb-IX-V诱导的血小板活化中起作用。为了进一步表征在依罗替尼治疗的患者的出血事件，我们研究这种药物的作用，对血小板功能在体外和离体14个例。 学习规划 对于体外实验，将来自没有抗血小板药物的健康供体的全血，富含血小板的血浆(PRP)或洗过的血小板与伊布替尼(PCI-32765; Selleckchem)或二甲基亚砜预孵育10或30分钟，如所示。用于离体实验，之前获得血样和开始依罗替尼治疗后2至4周;在CLL患者(ImbruvicaヤCilaq实验室)(每日420毫克)或MCL(每日560毫克)(法国体恤根据赫尔辛基宣言，在知情同意后使用计划。该研究得到了图卢兹医院的机构审查委员会的批准。排除抗血小板治疗或血小板计数<80×10 9的患者/ L，包括14名患者，其特征在补充表1中报告，可在血液网站上获得。在由柠檬酸盐血液(聚集)或肝素化全血(粘附到VWF)制备的PRP中进行实验。大多数实验室方法已在前面描述过12并在补充材料中报告。使用配对或非配对Student t检验(Excel软件，* P <.05和** P <.01)进行统计学分析。 结果和讨论 伊布替尼在体外抑制胶原蛋白和胶原相关肽诱导的血小板聚集和PLCγ2磷酸化 在临床上可实现的剂量(0.5μM)，依罗替尼对由血栓素A2模拟U46619，凝血酶相关肽，或凝血酶诱导洗涤血小板的聚集没有影响，但剂量依赖性地抑制胶原诱导的血小板聚集。该作用伴随着对Btk依赖性磷酸化位点Tyr753的PLCγ2磷酸化的抑制。14低浓度的伊布替尼强烈降低PLCγ2磷酸化，对Src家族激酶活化(Tyr416的磷酸化)和胶原蛋白刺激的血小板中酪氨酸磷酸化的整体模式没有影响。较高的伊布替尼浓度(≥0.5μM)一致地降低了Src家族激酶活化和几种蛋白质的酪氨酸磷酸化。伊布替尼针对激酶筛选组的选择性测试表明，在体外该药物浓度下，几种Src激酶确实可能受到影响。伊布替尼剂量依赖性地抑制Btk自身磷酸化(Tyr223)和胶原相关肽(CRP)在洗涤血小板中诱导的聚集。伊布替尼还抑制PRP中胶原诱导的血小板聚集，IC 50值为0.5μM，几乎是治疗患者血浆中的峰值剂量。在PRP混合实验正比于未处理的血小板(补充图3A)显示聚集缺陷胶原和Tyr223-的Btk自磷酸化的校正以CRP。这与伊布替尼的不可逆作用一致，并表明血小板输注可能是纠正止血的一种选择。 伊布替尼对血小板对胶原，CRP和VWF反应的影响。(A)用指定浓度的伊布替尼处理或不处理来自健康供体的洗过的血小板10分钟并用不同的激动剂刺激(胶原，3.3μg/ mL; CRP，9μg/ mL;U46619,5μM;凝血酶受体激活肽，50μM;凝血酶，0.5UI / mL)。通过比浊法评估血小板聚集，结果表示为聚集百分比，均值±平均值的标准误差(SEM;胶原：n = 12; CRP和其他激动剂：n = 6)。与聚集平行，通过蛋白质印迹(整个血小板酪氨酸磷酸化模式，Tyr-753上的PLCγ2磷酸化和Src磷酸化)评估伊布替尼对响应于用(BC)胶原或(D)CRP刺激1分钟的血小板信号传导的作用。在Tyr-416上或通过流式细胞术在Tyr-223上进行Btk磷酸化。(插图)(a)静息，(b)CRP刺激和(c)CRP刺激的伊布替尼处理的血小板中的荧光强度(MFI)。显示的蛋白质印迹代表3个独立实验。Western印迹定量的结果是3至6个独立实验的平均值±SEM。(E)增加剂量的伊布替尼对PRP中胶原诱导的血小板聚集的影响(n = 4，平均值±SEM)。(F)伊布替尼对动脉血流条件下血小板粘附VWF的影响(4000 s全血中-1或180 dyn / cm 2)。在这些流动条件下，血小板粘附依赖于GPIb，如通过单克隆GPIb抗体的完全抑制所证实的(数据未显示)。将来自健康供体的血液用0.5μM伊布替尼或二甲基亚砜预孵育30分钟。在流动5分钟后，通过测量血小板表面覆盖值(平均值±SEM，来自3个独立位置)，用含有Ca 2+ / Mg 2+的磷酸盐缓冲盐水在4000s -1下洗涤1分钟后，定量牢固的血小板粘附。实验)。* P <.05和** P <.01。比例尺：50μm。 伊布替尼在高剪切速率下体外抑制血小板与VWF的粘附 VWF与GPIb-V-IX的结合是将血小板束缚至受损血管壁以及血流下整联蛋白介导的血小板停滞所必需的。VWF-GPIb相互作用通过与PLC和细胞内钙动员相关的剪切敏感信号传导途径刺激滚动血小板中的细胞骨架重组。15使用伊布替尼预孵育来自健康供体的血液，在高剪切速率下降低了坚固的血小板与VWF的粘附(图1F)，同时保留了血小板滚动(补充视频1)和GPIb的表达(补充图2A)。 伊布替尼对CLL和MCL患者的止血相关不良反应与血小板功能障碍相关 从14名患者中，5名显示出与治疗相关的止血缺陷，包括自发性瘀伤，浅表性出血或鼻出血，而所有患者均对该药物有临床反应(补充表1)。PRP中的标准透光聚集测定表明，在所有测试的患者中，伊布替尼治疗对腺苷5'-二磷酸 - 或U46619诱导的血小板聚集没有或具有非常小的影响。7名患者表现出血小板聚集成胶原蛋白的显着缺陷。所有出血素质的患者都表现出对PRP中胶原诱导的聚集的强烈抑制。在6名患者中分析了坚固的血小板粘附到VWF上。与没有出血症状的患者相比，流出患者的血小板在流量下几乎不粘附于VWF。 用Imbruvica(伊布替尼)治疗的CLL和MCL患者的血小板功能。(A)在治疗开始前(第0天)和治疗2至4周后(第15-30天)收集临床和生物学数据。在第0天和第15至30天，评估由PRP上的胶原(3.3μg/ mL)，腺苷5'-二磷酸(5μM)或U46619(5μM)诱导的血小板聚集，并表示为平均值±SEM 。值得注意的是，与健康供者相比，患者组第0天胶原诱导的血小板聚集略微减少(健康供者为88±6%，患者为69±7%，P<.01，n = 19名健康捐赠者)。值得注意的是，在第15至30天的非出血组中，患者06和10具有强烈的聚集减少。重要的是，患者06($)在第50天出现严重的子宫出血。，评估6名患者(01,02,03,07,08和14)的VWF基质上的血小板粘附，并表示为表面覆盖。结果表示为平均值±SEM。(B)患者(01)的实例，其显示伊布替尼治疗的血小板功能障碍和出血症状。(C)患者(08)的实例，其具有正常的血小板反应并且对伊布替尼治疗没有止血相关的副作用。高白细胞增多与离体血小板功能障碍无关。* P <.05和** P <.01。D0，第0天; D15，第15天。 这种效应似乎是可逆的，如1名患者(03)所示，由于感染并发症而中断了伊布替尼治疗。胶原诱导的血小板聚集的恢复与预期的生理血小板更新速率平行，分别在治疗中断后60和168小时恢复近半数最大和完全聚集。 更多推荐阅读： 卡博替尼新适应症：急性髓细胞白血病治疗 治疗白血病，伊布替尼能成为下个格列卫吗? 慢性淋巴细胞白血病可用依鲁替尼进行治疗